请教CRISPR行家-HDR Template Design

http://www.mitbbs.com/article_t/Biology/31925927.html

发信人: midwestPstD (中西部博士后), 信区: Biology
标  题: 请教CRISPR行家-HDR Template Design
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Nov 18 16:24:10 2014, 美东)

看了Zhang Feng的Nature Protocol关于CRISPR的文章，Figure 6里面的ssDNA
template明显的效率比plasmid作template高。文章并没有明确说明哪个template好。
想了一下，ssDNA分子量比plasmid小多了，同样的ug template, ssDNA的分子数肯定多
多了，也许这是一个解释。

我自己在设计HDR template，想两边各一个Kb的homologous arm,中间有60-70bp 的
mutation insertion。这个两kb的DNA准备克隆到一个plasmid里面，sequencing确定
mutation后，就可以用作HDR template了。

想请教的是：需要把这个两Kb的template从plasmid里面酶切出来，gel纯化后再和cas9
plasmid一起co-transfect吗？要作ssDNA太难了一点，还没考虑。：（。

很多年前作过ssDNA的transfection（pUC18？phage-ssDNA纯化的)，记得当时发现
ssDNA在真核细胞内不如dsDNA的plasmid稳定呢。不知道dsDNA fragment在细胞内是不
是也象环状的plasmid那么稳定。

多谢！